Синтетичен живот: Изработен от нулата

Защо даването на организми с неестествени функции изисква по-добро разбиране на биологията, дизайнерските протеини и търсенето на душа.

Маслени капчици във вода, често срещан подход за създаване на „протоклетки“, затворени в липидите. Снимка от A_Different_Perspective Pixabay. Вижте: https://www.nature.com/articles/ncomms6305

Синтетичната биология е научна дисциплина, която цели рационално инженерство на живи организми, обикновено с подходи на генно инженерство (1). През 1961 г. Франсоа Якоб и Жак Монод първи предлагат генетичните регулаторни схеми да насочват клетъчното поведение (2). До 2000 г. учените успешно проектират неестествени генетични вериги, имплантират ги в микроорганизми и веригите изпълняват определената им функция. Ранните примери включват превключвателя за генетично превключване (3), при който два промотора задвижват експресията на взаимно инхибиращи репресори, причинявайки клетката да се превключва между стационарни състояния и репресилатора (4), който се появи през същата година.

Генетичните вериги са вдъхновени от електрически вериги и са изградени от подобни принципи, от geralt Pixabay.

Днес прилагането на инженерни методологии за рационалното модифициране на организмите е постоянна цел на синтетичната биология. Повечето синтетични биолози описват биологичното инженерство като йерархия, при която части (гени, ДНК) се използват за изграждане на устройства (много гени заедно), които от своя страна могат да бъдат използвани за изграждане на системи (серия от много устройства) (1). Предизвикателството при превръщането на синтетичната биология в истинска инженерна дисциплина е, че частите, които са основни градивни елементи на конструкции от по-висок ред, са ограничени в основата на строгостта на тяхната характеристика. Това наистина е така във всички утвърдени инженерни дисциплини. Например в електротехниката основните компоненти (транзистори, резистори, проводници и т.н.) са характеризирани толкова добре, че децата могат да ги използват и получените схеми се държат според очакванията. След като всички „части“ са стандартизирани, може би е възможно синтетичните биолози да използват отделни строителни блокове на ДНК, за да конструират изцяло синтетични форми на живот отдолу нагоре.

Бюст на Аристотел. Снимка от morhamedufmg Pixabay.

Идеята за синтетичния живот съществува от хилядолетия. През 4 век пр. Н. Е. Аристотел пише за спонтанното поколение в своята книга „За поколението на животните“, която твърди, че разлагащата се плът дава изцяло нови форми на живот. Към 20 и 21 век възникват сериозни етични проблеми, свързани с изкуствения живот. През 2005 г. бактериофагът Т7 вирусът беше успешно „възстановен“, като замести 11 555 базови двойки ДНК със синтетична форма и жизнеспособността на запазените вирусни частици (5). Две години по-късно J. Craig Venter успява да трансплантира хромозоми между микроорганизми (6) и на следващата година публикува завършен изкуствен геном на базата на M. genitalium (7). През 2010 г. компонентите бяха сглобени и M. genitalium, съдържащ „синтетичен“ геном, беше успешно конструиран (8).

Продължаващ международен проект, наречен Synthetic Yeast 2.0, се опитва да конструира първия еукариотен организъм, притежаващ химически синтезиран геном (9). Най-амбициозният пример за изграждане на синтетичен геном досега, всеки институт-член конструира и отстранява проблеми по една от 16-те дрождени хромозоми. В следващите няколко години те се надяват да произведат напълно „синтетични“ дрожди, притежаващи всички тези химически синтезирани хромозоми.

Миналата година групата на Ромесберг в The Scripps Research Institute публикува създаването на „полусинтетична форма на живот“, която предоставя първите доказателства за микроорганизъм със синтетични нуклеотиди в генома му (наречени X и Y), чийто код е успешно транскрибиран и преведен, като по този начин разширява наличните аминокиселини за живите клетки от 20 на 172 (10). Ромесберг внимаваше да предаде резултатите си пред медиите, като заяви: „Не бих нарекъл това нова форма на живот - но това е най-близкото нещо, което някога е правил“ (11).

Най-близкото усилие днес да се изгради нещо, което наистина може да се нарече синтетичен живот, е консорциумът Build-a-Cell, който има за цел да изгради синтетични клетки от земята, използвайки модулни компоненти. Теоретично клетка, притежаваща всички гени, необходими за основен метаболизъм, клетъчно делене, сигнализиране и няколко други задачи, може да се счита за жива и изградена изцяло от добре характеризирани блокове.

Но какво да кажем за развитието на организми, които притежават изцяло нови функционалности - тези, които не се срещат никъде в природата? Как синтетичните биолози могат да преминат отвъд пренасочването на съществуващи компоненти (което е постигнато само частично) и да се преместят в царството на неизвестните? Има много предизвикателства, ограничаващи този преход, но той ще се случи в крайна сметка. Една изкуствена жизнена форма, тази, която се базира само на съществуващ организъм, може да бъде изградена само ако неговият разработчик има цялостно разбиране за това как работи животът и може да предскаже как всеки компонент ще се държи в клетката. Тъй като протеините са едно от най-важните средства, чрез които клетката изпълнява функциите си, е безспорно, че подобреното разбиране на протеиновата функция и способността да се проектират протеини с изцяло нови функции биха могли да улеснят този преход.

Има три основни „предизвикателства“ в разработването на синтетични форми на живот с нови функционалности. Въпреки че примерите, предоставени тук, по никакъв начин не са изчерпателни, те обхващат научното, технологичното и етичното.

Научно предизвикателство: Неизвестни протеинови функции

Синтетичната биология е дисциплина, разчитаща на паралелен напредък в геномиката, молекулярната биология и изчисленията. За да се разработят организми по предсказуеми начини, трябва да се разбере добре техните тънкости, различия и, което е важно, функцията на всеки компонент, преди компонентите да могат да бъдат пренаредени и трансплантирани по желание. Това е научното предизвикателство.

За да намерите убедителен пример на съществуващите, ярки пропуски в научните знания, които трябва да бъдат преодолени, преди да се създаде живот наново, не трябва да се търси повече от усилията за изграждане на минимален геном, завършен през 2016 г., в който геномът на Mycoplasma mycoides беше сведен до само 473 гена (12). Може би е изненадващо, че през 2012 г. това усилие бе предшествано от създаването на модел на цяла клетка, основан на простия организъм Mycoplasma genitalium, от групата на Маркус Коверт в Станфорд (13). Въпреки простотата на тези организми (Native genitalium има само 525 гена) и интензивните научни усилия, посветени на разбирането им, 149 основни гена в M. mycoides имат неизвестна функция (12).

Основно ограничение при конструирането на синтетични форми на живот е, че в исторически план основният метод за провеждане на биологични изследвания е да се изолират или нокаутират гените независимо и след това да се идентифицира тяхната функция в клетката. Този подход е полезен, но може да има недостатъци за изследване на всички сложни функции, в които участва, тъй като „... един компонент (като ген) рядко контролира конкретно някаква конкретна биологична функция или заболяване и обратно, всеки даден компонент може да повлияе много различни функции ”(1). За да се разбере как компонентите в клетъчната среда изпълняват своите функции, каноничните биохимични подходи отнемат време и трудоемки, но те могат да останат като необходимост. За подсказване на функцията от последователността обаче са използвани други подходи на системно ниво.

През месеците, които последваха публикуването на Venter на жизнеспособна, минимална клетка, Антоан Данчин и Ганг Фанг прогнозираха някои от неизвестните генни функции чрез еволюционен анализ, претърсвайки литературата, за да определят основни гени, които изпълняват основни функции в свързани бактериални кладове, които не са споменати като един от известните гени в микоидите с минимален геном (14). Използвайки тези еволюционни връзки, Данчин и Фанг предложиха идентичност за 32 от 149 неизвестни гена (14). Но минималната клетка (и нейният предшественик) не са единствените сравнително прости организми, които са били подробно проучени и еволюционните връзки не са единственият начин за изучаване на функцията на протеина. Изследователите на дрожди отдавна търсят нови методи за определяне на функцията на неизвестни гени. През 2007 г. в дрождите е имало над 1000 нехарактерни гена (15).

Едно е да се извърши хомология или еволюционни анализи на големи набори от данни, но съвсем друго е да се изолира въпросният протеин и да се извършат ензимни изследвания или да се изтрие генът in vivo, за да се изследват неговите ефекти. При основните гени при делецията е по-трудно да се получат резултати от, но все още има възможности за изследване на протеиновите функции, като проследяване на флуорофор, имунопреципитации, имуноблотиране и фармакологични инхибитори. Макар и отнемащ време и трудоемък, може би биохимичният подход, базиран на доказани инструменти, все още е най-добрият метод за определяне на функцията.

След като се определи функцията на всеки компонент, следващата стъпка е да се използват подходи на системно ниво, за да се разбере как те функционират в по-големия клетъчен контекст. Това е задачата на системните биолози, които „се стремят да разберат как всички отделни компоненти на биологична система си взаимодействат във времето и пространството, за да определят функционирането на системата. Тя позволява да се вникне в голямото количество данни от молекулярната биология и геномните изследвания, интегрирани с разбирането на физиологията, за моделиране на сложната функция на клетки, органи и цели организми ”(16). Днес ограниченото разбиране на протеиновата функция силно затруднява изграждането на синтетичен живот.

Технологично предизвикателство: Прогнозиране на функцията от последователността

В бъдеще би било полезно да се създадат клетки, които изпълняват индивидуално предназначение, дори ако тази цел изисква ензимна функция или поведение, които не се срещат никъде в природата. С напредъка в прогнозирането на протеиновата структура и функция от последователността на ДНК, „модулността“ на части, които един ден биха могли да бъдат използвани за изграждането на биологични организми отдолу нагоре, ще бъде драстично разширена. Докато някои изследователски групи работят за създаването на протеини с напълно нови функции, включително групата на Нобеловия лауреат на Франсис Арнолд за 2018 г., отчаяно са необходими по-добро разбиране на протеиновата функция и инструменти за надеждна разработка на протеиновата структура. Основно технологично предизвикателство, свързано със създаването на изцяло „неестествени“ организми, е: какви методи могат да се използват за изграждане на протеини с нови функционалности и по какви начини сме ограничени?

„Проблемът с преглъщането на протеини“ е решен от много групи, може би нито една толкова известна като Дейвид Бейкър от Вашингтонския университет. Групата на Бейкър е забележителна (отчасти) с развитието им на ROSETTA и ROSETTA @ Home, програма за прогнозиране на протеиновата структура и нейната версия за домашна употреба, в която хората на своите персонални компютри могат да работят за решаване на най-ниската енергийна структура за различни протеини (17). Бейкър също създаде компания за извличане, наречена Arzeda, която използва структурни платформи за прогнозиране за създаване на ензими с нови функционалности, които могат да се използват за екологични, диагностични и терапевтични приложения (20).

Изчислителните програми, разработени от групата Бейкър и други, са използвани за проектиране на напълно уникална протеинова гънка, която не се среща в природата (18) и за проектиране на протеиново-протеинови интерфейси за приложения в терапевтичния дизайн (19). Но едно ограничение на тока при проектирането на изцяло нови биологични структури е изчислителната мощност. Ab initio симулациите обикновено сондират и тестват много конформационни протеинови състояния, за да идентифицират структури с най-ниска свободна енергия (20, 21). През 2009 г. състоянието на суперкомпютъра може да симулира протеин с 50 остатъка, атом по атом, за 1 милисекунда. Оттогава тази възможност е превишена от личните компютри (22, 23).

За съжаление, прогнозирането на протеиновата функция от ДНК последователност е много по-сложно от предвиждането на протеиновата структура. Способността за прогнозиране на протеиновите функции може да даде възможност за бързо, рационално проектиране на протеини с изцяло нови дейности. Групата на Франсис Арнолд от Калифорнийския технологичен институт се справя с този проблем, като използва „най-мощния процес на биологично проектиране, еволюция, за оптимизиране на съществуващите ензими и изобретяване на нови, като по този начин заобикаля дълбокото ни незнание как функционира кодирането на последователността.“ Еволюцията е толкова голяма инструмент за разработване на нови протеини, отчасти, защото мутациите, необходими за прилагане на нова полезна функция, често са силно неинтуитивни. Въпреки че повечето аминокиселини, отговорни за субстратната специфичност или селективност, се намират в активното място, промените в аминокиселини, отдалечени от активния сайт, могат също да доведат до драстично засилени каталитични активности (24).

Кулминацията на подходите, включващи изчисляване, дизайн и еволюция, е най-вероятно да успее да създаде все по-сложни протеини по дизайн.

Обществено и етично предизвикателство

Етиката на синтетичната биология е силно оспорвана след първите доклади за генетични вериги, публикувани в началото на 2000-те, а докладът за химически синтезиран геном през 2010 г. подтикна администрацията на Обама да създаде комисия по биоетика, която да се справи с новите възможности в синтетичната биология ( 25). По време на тази инициатива етиците твърдят, че ако учените успеят да създадат организма, самият живот може да загуби своя специален статус (26). С други думи, хората биха започнали да разглеждат живота като нищо повече от поредица от сложни биохимични реакции, които могат да бъдат повторени в лаборатория и създаването на редукционистски, синтетичен организъм би уронвало този специален статус.

Редукционисткият морален аргумент срещу създаването на синтетичен живот също е свързан с методологическия редукционизъм, стратегия, която инженерните дисциплини са използвали за систематично редуциране на компоненти, за да разбере по-нататък как е изградено цялото. Такъв е случаят със стандартизацията в синтетичната биология, при която всеки компонент се характеризира индивидуално и въпреки това не е имало обратен етичен ефект над систематичната биологична стандартизация. Това обаче са същите редукционистки принципи, които ще позволят евентуалното създаване на синтетична форма на живот. И накрая, няма доказателства, които предполагат, че предишните усилия за изграждане на полусинтетичен живот, споменати по-рано в тази статия, и организмите със синтетични геноми по някакъв начин са повредили специалния статус, който хората приписват на живите организми, въпреки медийното внимание.

Въпреки това, има ключови етични моменти, които трябва да се разгледат, преди да бъдат изградени синтетичните форми на живот. Насоките, изложени от Вайце и Пюлер, са особено проницателни (27). Първо, имат ли учени всички необходими знания и цялостно разбиране на въпросната технология? Само защото учените могат да построят нещо, не означава, че трябва. Съответно учените трябва да работят за пълното разбиране (където е възможно!) На биологичните принципи, играещи се в организма, така че потенциалните проблеми да бъдат предотвратени или смекчени.

Трябва да се вземат предвид и потенциалните вреди на нов синтетичен организъм. Хората често използват технологиите по неочаквани начини, затова е важно потенциалните приложения на синтетичния организъм да се обсъждат проактивно. Правителствените разпоредби и етичните съображения трябва да се отчитат много преди началото на действителното строителство.

Рамката за отговорни изследвания и иновации, разработена от EPSRC (Съвет за инженерни и физически науки, основната агенция за финансиране на инженерните и физическите науки на Обединеното кралство), призовава за синтетични изследвания на биологията да се проведат с помощта на AREA, което означава „Предвиждам, размишлявам“ , Ангажирайте се и действайте (28). Изследователите трябва да проучат изцяло въздействието на своя изследователски проект, преди да се впуснат в него, да разсъждават върху целите за провеждане на изследването, да участват с хора извън тяхната собствена дисциплина, включително биоетици, и след това да действат върху тези процеси и да определят направлението на своите изследвания. проект съответно.

В следващите десетилетия ще бъдат проектирани и конструирани клетки с изцяло уникални, неестествени функционалности. Напредъкът, постигнат днес, е стъпка към постигането на тази по-голяма цел и може да доведе до нова ера на синтетичната биология, където организмите са създадени ad hoc за справяне с някои от най-належащите проблеми в света.

Препратки

1. „Синтетична биология: обхват, приложения и последствия.“ Кралската академия на инженерите. Май 2009 г. Достъп до 2 декември 2017 г.

2. Jacob F и Monod J. „Генетични регулаторни механизми в синтеза на протеини.“ Journal of Molecular Biology 3, 318–356 (1961).

3. Gardner TS, Cantor CR и Collins JJ. „Изграждане на генетичен превключвател в Escherichia coli.“ Nature 403, 339–342 (2000).

4. Elowitz MB и Leibler S. „Синтетична осцилираща мрежа от транскрипционни регулатори.“ Nature 403, 335–8 (2000).

5. Chan LY, Kosuri S и Endy D. „Рефакториращ бактериофаг T7.“ Mol Syst Biol 1 (2005).

6. Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, et al. „Трансплантация на геном при бактерии: промяна на един вид в друг.“ Science 317, 632–8 (2007).

7. Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, et al. „Пълен химичен синтез, сглобяване и клониране на геном Mycoplasma genitalium.“ Science 319, 1215–20 (2008).

8. Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, et al. „Създаване на бактериална клетка, контролирана от химически синтезиран геном.“ Science 329, 52–6 (2010).

9. Annaluru N, Muller H, Mitchel LA, et al. „Тотален синтез на функционален дизайнер еукариотична хромозома.“ Science 344, 55–8 (2014).

10. Zhang Y, Ptacin JL, Fischer EC, et al. „Полусинтетичен организъм, който съхранява и извлича повишена генетична информация.“ Nature 551, 644–47 (2017).

11. „Учените създават първи полусинтетичен организъм, който съхранява и извлича неестествена информация.“ Новини на изданието на Scripps Research Institute. 29 ноември 2017 г. Достъп до 2 декември 2017 г.

12. Hutchison CA, Chuang R, Noskov VN, et al. „Проектиране и синтез на минимален бактериален геном.“ Science 351, 1414 (2016).

13. Karr JR, Sanghvi JC, Macklin DN, et al. „Компютърният модел на цели клетки предсказва фенотип от генотип.“ Cell 150, 389–401 (2012).

14. Danchin A и Fang G. „Неизвестни неизвестни: основни гени в търсенето на функция.“ Microb Biotechnol 9, 530–40 (2016).

15. Peña-Castillo L и Hughes TR. „Защо все още има над 1000 нехарактеризирани гена на дрожди?“ Генетиката 176, 7–14 (2007).

16. „Системна биология: визия за инженерство и медицина“. Академия за медицински науки и Кралска академия на инженерите (2007).

17. Kaufmann KW, Lemmon GH, DeLuca SL, Sheehan JH и Meiler J. „Практически полезни: Какво може да направи ROSETTA Suite за моделиране на протеини за вас.“ Biochemistry 49, 2987–98 (2010).

18. Kuhlman B, Dantas G, Ireton GC, Varani G, Stoddard BL и Baker D. „Дизайн на нова глобуларна протеинова гънка с точност на атомно ниво.“ Science 302, 1364–68 (2003).

19. Ashworth J, Havranek JJ, Duarte CM, et al. „Изчислително препроектиране на свързване и специфичност на разцепване на ендонуклеаза на ДНК“. Nature 441, 656–59 (2006).

20. Jiang L, Althoff EA, Clemente FR, et al. „De novo изчислителна конструкция на ретро-алдолните ензими.“ Science 319, 1387–91 (2008).

21. Simons KT, Bonneau R, Ruczinski I и Baker D. „Прогнозиране на протеиновата структура на Ab initio на CASP III с помощта на Rosetta.“ Протеини 37, 171–76 (1999).

22. Shaw DE, Bowers KJ, Edmond C, et al. „Протокол от конференцията за високоефективните компютърни мрежи, съхранение и анализ - SC '09.“ (2009).

23. Pierce LCT, Salomon-Ferrer R, de Oliveira CAF и др. „Рутинен достъп до събития в милисекунда време с ускорена молекулярна динамика.“ J Chem Theory Comput 8, 2997–3002 (2012).

24. Tracewell CA и Arnold FH. „Насочена ензимна еволюция: фитнес за катерене достига максимално една аминокиселина.“ Curr Opin Chem Biol 13, 3–9 (2009).

25. Поллак А. “САЩ Комисията за биоетика дава зелена светлина на синтетичната биология. ”The New York Times. 16 декември 2010 г.

26. Cho MK, Magnus D, Caplan AL и McGee D. „Етични съображения при синтеза на минимален геном.“ Science 286, 2087–89 (1999).

27. Weitze M и Pühler A. „Синтетичната биология - към инженерната наука.“ European Review 22, S102–12 (2014).

28. „Рамка за отговорни иновации“. Изследователски съвет за инженерни и физически науки.